Оценка биохимических показателей крови при лечении инфицированных ран пептидом HLY-GYS-LYS-D-HLA в разных концентрациях
Введение
Актуальность. Раневая инфекция — комплекс общих и местных патологических проявлений, возникающих при развитии инфекции в случайных или операционных ранах. Она стала одним из основных видов осложнения в хирургии, так как процент частоты возникновения гнойных заболевания и послеоперационных нагноений составляет от 20 до 60 .
Проблема современной медицины состоит в том, что сроки лечения раневых инфекций остаются продолжительными, а частота аллергических реакций и летальных исходов возрастает. По данным ВОЗ около 30% послеоперационных больных страдают гнойно-воспалительными заболеваниями, вызванными госпитальной инфекцией, а 18-20% случаев заканчиваются летальным исходом.
Для ускорения очищения ран часто используются протеолитические ферменты, а для борьбы с раневой инфекцией эффективными являются антисептики, но проблема состоит в том, что в раневой среде ферменты быстро теряют устойчивость, а антисептики очень сложно поддерживать на уровне определенной концентрации в повязке.
Именно поэтому было предложено решить данную проблему с помощью пептидных молекул, которые играют главную роль в поддержании гомеостаза организма. Выявление эффектов от применения пептидов составляет большой практический интерес для повышения выздоровления больных, переносящих раневую инфекцию различного генеза.
В основе физиологии органов и тканей лежат процессы
Одним из пептидов, играющих большую роль в регенерации и дифференцировке клеток, является пептид HLY-GYS-LYS-D-HLA,но в то же время его влияние на процессы регенерации изучены не до конца.
Цель исследования: Общая оценка биохимических показателей крови при лечении инфицированных ран пептидом HLY-GYS-LYS-D-HLA в различных концентрациях
Задачи исследования:
1)Изучить изменения биохимических показателей крови при воздействии на инфицированные раны пептидом HLY-GYS-LYS-D-HLA в концентрации 0,5 мкг/кг в сравнении с контролем
2)Изучить изменения биохимических показателей крови при воздействии на инфицированные раны пептидом HLY-GYS-LYS-D-HLA в концентрации 1,5 мкг/кг в сравнении с контролем
3)Сравнить между собой биохимические показатели крови инфицированных ран крыс пептидом HLY-GYS-LYS-D-HLAв концентрации 0,5 мкг/кг и пептидом HLY-GYS-LYS-D-HLA в концентрации 1,5 мкг/кг
Глава 1.Обзор литературы.
1.1 Этиология, патогенез, клиника и морфология раневого процесса.
Рана (vuenus) — повреждение тканей и органов с нарушением целости кожи или слизистых оболочек, вызванное механическим воздействием, сопровождающееся болью, кровотечением и зиянием.
Возбудителями раневой инфекции являются условно-патогенные аэробные или анаэробные микроорганизмы, постоянно сосуществующие с организмом человека: стафилококки, стрептококки, энтерококки, кишечная палочка, протей, клебсиеллы, синегнойная палочка, клостридии, бактероиды, фузобактерии. До 90-100% возбудителей раневой инфекции эндогенного происхождения.
На современном уровне уже недостаточно знать только качественное определение состава микрофлоры раны. Необходимо знать и количественные характеристики для прогнозирования течения инфекционного процесса. Установлен критический уровень микробного загрязнения — более 105 бактерий в 1 г ткани края раны.
Состав микрофлоры, а также количество микробов играют определенную роль в возникновении инфекционного процесса. В борьбе за выживание микрофлора постоянно видоизменяется, приспосабливается: если в 40-х годах XX века в ранах постоянно преобладали стрептококки, то постепенно произошло их вытеснение стафилококками, а в последние годы на первый план стали выступать неспорообразующие анаэробы: кишечная палочка, синегнойная палочка, протей, бактероиды, и т.д. Широкое применение сульфаниламидов и антибиотиков обусловило селекцию устойчивых к антибиотикам штаммов. Все эти изменения возбудителей ведут к изменению клинической картины инфекционных осложнений.
Некоторые авторы выделяют три основных этиологически значимых типа течения хирургической инфекции:
1)Вызванные монокультурой возбудителя,
2)Вызванные ассоциациями микроорганизмов,
3)Вызванные изменениями видового состава возбудителей в ходе заболевания.
Развитие возбудителей в ране проходит три стадии.
1. Стадия микробного загрязнения — контаминация. Случайные комбинации микробов проникают в рану в момент ранения — первичное микробное загрязнение или в ходе эвакуации и лечения — вторичное микробное загрязнение.
2. Стадия микрофлоры раны — колонизация. Спустя 12 ч после ранения формируются ассоциации микробов, возникающие в результате селекции при взаимодействии с данным организмом;
3. Стадия раневой инфекции — выход микробов за пределы раны, размножение их в живых тканях с общими проявлениями интоксикации. Симптомы раневой инфекции обычно появляются на 3-5-е сутки после ранения.
Раневой же процесс протекает в несколько, переходящих друг в друга фаз:
Воспаление, очищение, репарация.
Для 1-й фазы (1-4-е сутки после ранения) характерно возбуждение симпатического отдела вегетативной нервной системы, сопровождающееся повышенным выбросом адреналина в кровь, под влиянием которого повышается жизнедеятельность организма, основной обмен, усиливается распад белков, жиров и гликогена, снижется проницаемость клеточных мембран, угнетаются механизмы регенерации, повышается свертываемость крови. Повышается активность коркового вещества надпочечников, выделяющего глюкокортикоидные гормоны, которые оказывают противовоспалительное действие. Таким образом, в ответ на полученную травму развивается адаптационный синдром.
Для 2-й фазы (4-10-е сутки после ранения) характерно повышенное влияние парасимпатического отдела вегетативной нервной системы, действие минералокортикоидных гормонов, альдостерона, активируется процесс регенерации. В этой фазе происходит нормализация обмена веществ, особенно белкового, активизируется процесс заживления раны.
В 1-й фазе (очищения или гидратации) раневой процесс характеризуется рефлекторной ответной реакцией со стороны нервной системы на местное раздражение интерорецепторов, что выражается в гиперемии, расширении сосудов, нарушении проницаемости, экссудации и эмиграции в окружающие ткани лейкоцитов и эритроцитов; отмечаются стаз, тромбозы и дегенеративные изменения тканей. Факторы, содействующие гидратации тканей при воспалении, способствуют более быстрому закономерному течению процесса (экссудации, отторжению омертвевших тканей).
Биохимические сдвиги в ране проходят параллельно морфологическим изменениям в ней: изменяется среда, соотношение кислотных и щелочных радикалов; в раневом участке происходит сдвиг среды в кислую сторону, ацидоз. Изменяется и соотношение калия и кальция в сторону увеличения калия. Увеличение ионов водорода и калия еще больше усиливают расширение сосудов и экссудацию.
Лейкоциты, омываемые тканевым соком, проникают в ткани через стенки капилляров и выполняют свою функцию фагоцитоза. Во 2-й фазе наблюдаются обратные явления: нормализуется кровообращение, уменьшается проницаемость, постепенно суживаются кровеносные сосуды, развивается сеть вновь образовавшихся капилляру уменьшается или прекращается экссудация и эмиграция, идет восстановление потерянной (некротизированной) ткани путем развития рубцовой ткани с последующей эпителизацией. Эти закономерности характерны как для ран, заживающих первичным натяжением, так и для ран, заживающих вторичным натяжением.
2-я фаза раневого (воспалительного) процесса, фаза дегидратации или фаза регенерации — характеризуется восстановительными процессами на месте погибших клеток и тканей. Во 2-й фазе отмечаются понижение обмена веществ, что совпадает с понижением температуры, кислотности раны, уменьшение калия и увеличение кальция в ране, уменьшение гиперемии. Происходит уплотнение новообразований ткани. Продукты распада тканей, токсины удаляются из воспалительного очага вследствие фагоцитоза, ферментативных и гормональных процессов.
В очищение раны большую роль играют:
• автолизаторы, то есть тканевые ферменты, продукты распада клеток и лейкоцитов;
• гетеролизаты, продукты ферментативной деятельности лейкоцитов при их распаде;
• некрогормоны, продукты белкового распада, аминокислоты;
• липоиды и др.; они стимулируют процессы обмена, если находятся в незначительном количестве, и угнетают регенеративный процесс, при значительном скоплении продуктов распада.
Существует множество классификаций для описания динамики воспалительного процесса.
Классификация Б.М.Даценко, основанная на клинических критериях, отражает сущность каждой фазы раневого процесса, согласно которой различают три последовательные фазы его течения в гнойной ране:
1)Гнойно-некротическая фаза, клинически характеризуется наличием некротических тканей и гнойного содержимого в ране, края которой отечны и инфильтрированы
2)Фаза грануляций, клинически проявляется очищением раны от гнойно-некротического секвестра и образования в ней грануляционной ткани, постепенно выполняющей полость раны;
2)Фаза эпителизации, характеризующаяся эпителизацией раневой поверхности и реорганизацией рубца.
Длительность каждой фазы заранее не известна ,и определить ее невозможно ,стабильной остается ишь последовательность этих фаз, каждая из которой характеризуется определенными морфологическими и функциональными изменениями в ране и окружающих тканях.
Учение по-разному определяют содержание каждой фазы, исходя из объекта своего исследования, так как невозможно определить четкую грань между окончанием одной и началом другой фазы.
Наиболее полной по мнению многих ученых является классификация М.И.Кузиной (1990),в которую входят следующие фазы:
1)Фаза воспаления, которую разделяют на периода: а)период сосудистых изменений и б)период очищения раны
2)Фаза регенерации- образование и созревание грануляционной ткани
3)Образование и реорганизация рубца.
По мнению Г.И Назаренко эта классификация требует уточнения и он с соавторами предлагает свою, так как по его мнению если рана начинает заживать сразу после ее нанесения, то да начала сосудистых изменения проходит какое то время, в течение которого проходят определенные подготавливающие сосудистые реакции, биохимические и морфологические изменения. В третьем же периоде происходит сначала эпителизация рубца, а только потом его реорганизация
На основании этого Назаренко с соавторами предлагают свою классификацию раневого процесса:
1)Стадия воспаления, которая включает в себя стадии альтерации, экссудации и вторичной деструкции(отторжение вторичных тканей и очищение раны)
2)Стадия репараций (образование грануляций и их организация)
3)Стадия ремоделирования (эпителизация рубца и его реорганизация, в результате чего происходит восстановление утраченных тканей)
Таким образом, процесс заживления ран протекает по единым биологическим законам, независимо от этиологии и локализации. В данном исследовании нам удобнее использовать классификацию М.И.Кузина, так как она наиболее проста в применении и в полной степени отражает течение раневого процесса, также она имеет большую связь с применением в клинике.
1.2Лечение инфицированных ран
В ходе многочисленных медицинских и научных исследований было выявлено, что главными задачами лечения местного гнойного воспаления являются: Подавление микрофлоры, устранение избыточной гидратации, купирование болей, адсорбция продуктов бактериального и тканевого распада, стимуляция репаративных процессов, защита от внутригоспитальной инфекции и мобилизация защитных сил макроорганизма. К лечению инфицированных ран нужно походить комплексно, учитывая этиологические и патогенетические особенности процесса.
Основой лечения ран является их хирургическая обработка. В зависимости от сроков проведения хирургическая обработка может ранней (в первые 24 часа после ранения), отсроченной (24-48 часов) и поздней (более 48 часов). В зависимости от показаний различают первичную (выполняемую по поводу прямых и непосредственных последствий повреждений) и вторичную хирургическую обработку (выполняемую по поводу осложнений, являющихся следствием повреждения).
Первичная хирургическая обработка
(ПХО) является ответственной операцией, от тщательности ее выполнения зависит все дальнейшее течение раневого процесса. Для ее надлежащего выполнения необходимо полноценное обезболивание (регионарная или общая анестезия; местная анестезия допустима лишь при обработке небольших поверхностных ран) и участие в операции как минимум двух врачей (хирурга и его помощника). ПХО ран разделяют на 3 последовательно выполняемых этапа: рассечение, иссечение и реконструкция.
Рассечение тканей. Как правило, рассечение производят через стенку раны, начиная с рассечения кожи, п/к клетчатки, чтобы осмотреть все слепые карманы раны. Возникающее по ходу разрезов кровотечение останавливают наложением кровоостанавливающих зажимов. В глубине раны вскрывают все слепые карманы. Рану обильно промывают растворами антисептиков.
Иссечение тканей. Иссекают: кожу (экономно, по возможности до здоровых тканей и появления капиллярного кровотечения). Исключением является область лица и ладонная поверхность кисти, где иссекают очевидно нежизнеспособные участки кожи. При обработке незагрязненных ран с ровными краями, в отдельных случаях допустимо отказаться от иссечения кожи, если нет сомнений в жизнеспособности ее краев; подкожно-жировую клетчатку (широко, не только в пределах видимого загрязнения, но и включая участки кровоизлияний, отслойки). Это вызвано тем, что подкожная жировая клетчатка, наименее устойчива к гипоксии и при повреждениях весьма расположена к некротизированию;
— фасцию (экономно, удаляя лишь разволокненные, загрязненные участки);
— мышцы. Это один из ответственных этапов операции, весьма затруднителен и этому может помочь только опыт хирурга. При ПХО раны на мышцы накладывают редкие швы с целью прикрытия костных отломков, обнаженных сосудов и нервов.
Операцию завершают инфильтрацией тканей вокруг обработанной раны растворами антибиотиков и установкой дренажей. Дренирование обязательно при ПХО любой раны. Для дренирования используют одно-и двухпросветные трубки от 5 до 10 мм с множественными перфорационными отверстиями на конце. Дренажи выводят через специально сделанные дополнительные отверстия (контрапертуры). По дренажам в рану начинают вводить антибиотики, или что предпочтительнее антисептики. Если рана зашита наглухо, к дренажам присоединяют вакуумный аспиратор для удаления раневого отделяемого и вводимых растворов. Если герметизация раны не производится, подключение аспиратора не достигает цели, в таких случаях раневое отделяемое само отходит по дренажам.
По окончании ПХО всегда приходится решать вопрос о том, зашить ли рану наглухо, частично или оставить ее открытой. Накладывание на рану при завершении ПХО швов называется первичным. Такой шов допустим тогда, когда:
— обработка выполнена в первые 6-8 часов после ранения;
— полностью удалены инородные тела, нектротизированные ткани, гематомы и участки микробного загрязнения;
— отсутствуют повреждения магистральных сосудов и нервных стволов;
— края раны сближаются свободно, без натяжения;
— общее состояние раненого удовлетворительное;
— имеется возможность постоянного наблюдения за оперированным в течение 4-5 суток.
Эти условия могут быть только при обработке неглубоких кожно-мышечных ран, чем и ограничивается применение первичных швов. Если такой уверенности нет, рану рыхло тампонируют.
Тампонирование раны проводится таким образом, чтобы марлевый тампон рыхло заполнил всю раневую полость.
Тампонирование раны преследует 3 цели:
— удержать рану открытой;
— обеспечить отток раневого отделяемого (гигроскопичен);
— создать в ране антисептическую среду.
Однако, активное хирургическое лечение раневого процесса невозможно без применения современных, активных, лекарственных препаратов.
Лекарственные вещества для лечения инфицированных ран широко применяются в медицинской практике и выпускаются в различных фармакологических формах: жидких, мягких, твердых и даже аэрозоли. Ниже приведены некоторые из этих форм:
1. Жидкие лекарственные формы:
• Гипертонические растворы
• Растворы антисептиков(растительного, животного, микробиологического, синтетического происхождения)
• Растворы полимеров
2. Мягкие лекарственные формы:
• Мазеобразные вещества (Линименты, крема, пасты)
• Гели
• Формуемые (суппозитории, медицинские карандаши)
• Пластыри
• Губки
3. Твердые лекарственные формы:
• Порошки, гранулы
4. Аэрозоли
Одним из самых эффективных методов лечения инфицированных ран является лечение под повязкой. Этот способ позволяет использовать широкий спектр лекарственных веществ, также при этом методе лечения достигается наибольшая и постоянная концентрация лекарственного вещества, что значительно ускоряет процесс заживления инфицированной раны. При этом методе лечения используется большой арсенал лекарственных веществ, содержащих биологически активные вещества из растительного сырья, например, ромашка, алоэ, также растворы антисептиков, таких как: бриллиантовый зеленый, метиленовый синий, йод, перекись водорода, перманганат калия. Также под повязку накладывают различные антибиотики животного, растительного, синтетического происхождения.
Важную роль, в быстром заживлении инфицированной раны играет применение современных перевязочных материалов.
Потребности современной медицины в высококачественных, удобных,экономичных расходных материалах привели к тому, что за последние годы на российском рынке появился широкий ассортимент новейших перевязочных средств, которые удовлетворяют самым высоким требованиям. При местном лечении ран, особенно с осложненным течением, необходим дифференцированный подход к применению перевязочных средств с учетом фазы и особенностей течения раневого процесса.
Несомненно, важными для развития современной методологии местного лечения являются результаты проведенного в нашем институте комплексного морфологического и морфометрического изучения стимулирующего действия раневых покрытий с использованием электронно-микроскопического и радиоавтографического методов, позволивших провести структурно-функциональный анализ процессов клеточного и внутриклеточного уровней регенерации. Эти исследования позволили обосновать эффективность стимулирующих раневых покрытий, а также дифференцировать механизм их воздействия на состояние клеток регенераторной ткани и ангиогенез.
В процессе накопления опыта по клиническому применению современной методологии местного лечения ран под повязками выдвигаются все новые требования к перевязочным средствам, а также уровню их исследований. Это касается создания биологически активных повязок для оказания первой медицинской помощи, новых композиционных стимулирующих раневых покрытий, биологически активных гидроколлоидных и пленочных повязок, изучения нового поколения биологически активных стимуляторов регенерации.
В 1962 в исследованиях Георга Винтера, английского биолога, было доказано, что лечение раны во влажной среде по отношению к сухой обработке показывает ускоренный процесс заживления.
Лечение раны в условиях влажной среды благодаря дальнейшим исследованиям за прошедшие годы, получила качественный скачок в развитии. Современные медицинско-экономические исследования дали возможность промышленности создать новые перевязочные средства, то есть современные продукты лечения ран.
Критерии современных перевязочных средств следующие:
• сохранение влажного климата в области раны
• удаление избыточного экссудата раны
• обеспечение газообмена
• изоляция раны от окружающей среды
• механическая и микробиологическая защита ран
• нетравматичное безболезненное удаление повязки
Уже сегодня имеется большое количество современных продуктов для лечения ран, которые могут применяться в зависимости от фазы заживления раны:
• альгинаты
• гидроколлоиды
• гидрогелипены
• полимеры/гидрополимеры
• пленки
• не прилипающие раневые повязки
• раневые повязки с активированным углем
• промывающие рану повязки
• биологически активные раневые повязки
Разумеется, следует также обратить внимание на то, что в распоряжении имеются другие современные раневые повязки в комбинированной форме.
В современной медицинской практике обосновался принцип влажного лечения ран современными продуктами лечения. При этом нужно, во-первых, наряду с очисткой раны надежнее защищать рану повязкой от внешних влияний. Во-вторых, современными повязками поддерживать физиологическую раневую среду, которая оптимальные условия для заживления раны. Современные продукты лечения ран в состоянии на основании своих качеств ускорить заживление раны.
Они создают оптимальную влажную среду, причем собирают и удерживают раневые выделения. Таким образом, выдерживаются все фазы заживления: воспаление (очищение и нормализацию процесса микроциркуляции, образование грануляционной ткани (ангиогенез)) и эпителизации. Кроме того, современные продукты не прилипают на влажное основание раны и могут удаляться при смене повязки без вреда для ткани и безболезненно.
Современные неадгезивные повязки:
Branolind – классическая гипоаллергенная мазевая повязка, которая, с успехом применяется в клиниках обще хирургического профиля, а также в ожоговых центрах, и особенно в системе «Медицина катастроф» в России. Обладая опытом лечения детей и взрослых можно с уверенностью сказать, что повязка Branolind оказывает высокий терапевтический эффект. Кроме того, были проведены мероприятия по исследованию биопсий в динамике заживления ожоговой раны с применением повязки Branolind. Данные гистологического и электронно микроскопического изучения процесса заживления говорят о благоприятном течении раневого процесса. Динамическое наблюдение выявило:
• стимулирующее влияние на процесс ангиогенеза;
• достаточно высокий индекс мечения клеток эпидермиса в стадии эпителизации (данные авторадиографии);
• сохранность зоны краевой и островковой эпителизации при безболезненной схеме повязки (без адгезии);
Перуанский бальзам, примененный впервые для лечения ран Амбруазом Паре (XVI век), далее научно обоснованная разработанная А.В.Вишневским (1925-1930гг.) мазь «Вишневского», выполняют роль антисептика и слабого раздражителя. А.В.Вишневский использовал перуанский бальзам в 3%-ной прописи и убедительно показал и обосновал хороший терапевтический эффект при заживлении ран у многих сотен тысяч больных и раненых. Как антисептик перуанский бальзам снижает уровень бактериальной обсемененности на грамм ткани, а как слабый раздражитель нервных окончаний оказывает стимулирующее влияние на регенераторный процесс (трофическое влияние по теории И.П.Павлова).
Syspur-derm – обладающая лечебным действием повязка из мягкой двухслойной полиуретановой губки, служащая для очищения раны и восстановления ткани, а также для временного покрытия больших кожных дефектов. Механизм воздействия повязки и ее терапевтические свойства определяются различными физическими структурами ее обоих губчатых слоев.
Показания к применению
Для очищения всех механических и термических ран, например, при инфицированных ссадинах, ожогах второй и третьей степени, открытых переломах и т.д. Для образования хорошо васкуляризированного участка при очищенных или первично чистых глубоких дефектах кожи и мягких тканей, открытых переломах, после некрэктомии, расширенных оперативных иссечениях т.д. Для очищения и стимулирования грануляции пр плохо заживающих ранах, например, трофических язвах, пролежнях, лучевых изъявлениях и т.д.
Syspur-derm не рекомендуется применять, если нет достаточной гарантии надежного контакта повязки с раневой поверхностью, так например при сухих некрозах, а также одновременного в сочетании с аппликациями из мазей,кремов и аэрозолей.
Syspur-derm накладывается на рану пористой стороной вниз. Внешняя сторона дополнительно идентифицируется голубой полосой.
Для того, чтобы обеспечить интенсивное очищение и восстановление функциональных способностей новообразованных тканей необходим надежный контакт Syspur-derm с раневой поверхностью. Поэтому при наложении повязки обрежьте повязку таким образом, чтобы он не выступал за края раны. Для фиксации компресса используйте легкий, воздухопроницаемый перевязочный материал. Для полной очистки раны рекомендуется менять компресс Syspur-derm каждые 12-24 часа. Затем в процессе восстановления функциональной способности кожи повязка может оставаться на ране в течение нескольких дней при условии ее ежедневного контроля.
Наиболее рациональной и удобной лекарственной формой для местного лечения ран являются мази, так как в них можно одновременно вводить гидрофильные и липофильные вещества, регулировать за счет основ их биодоступность, создавать необходимую концентрацию действующих веществ очаге поражения, также мази дают возможность для создания новых комбинированных и высокоэффективных лекарственных препаратов многонаправленного действия.
До недавнего времени наиболее активными в лечении инфицированных ран считались антибиотики, однако при их применении врачи столкнулись с рядом проблем, которые связаны с их мутагенным воздействием на их патогенную микрофлору, а также с появлением резистентных штаммов микроорганизмов. На фоне обнаруженных недостатков на первый план вышли такие лекарственные вещества как антисептики.
Антисептическими (от греч. «против гниения») называют противомикробные средства, которые задерживают развитие микроорганизмов, а дезинфицирующими — вещества, которые убивают микробы. Соответственно этому различают бактериостатическое действие, когда происходит остановка развития микроорганизмов, и бактерицидное действие, когда микроорганизмы полностью погибают.
По химическому строению антисептики распределяются по классам химических соединений, к которым они относятся, что отражает механизм их действия. Это группа галоидов (антиформин, йодоформ, йодинол), окислители (перекись водорода, перманганат калия), кислоты (салициловая, бензойная, борная), щелочи (нашатырный спирт), альдегиды (формалин, лизоформ), спирты (этиловый), соли тяжелых металлов (препараты ртути, серебра, меди, цинка, свинца), фенолы (кислота карболовая, лизол, резорцин), красители (метиленовый синий, бриллиантовый зеленый), мыла (зеленое), дегти, смолы, продукты переработки нефти (АСД, ихтиол, нефть нафталанская, озокерит), фитонцидные и другие растительные антибактериальные препараты (урзалин, настойка календулы, иманин).
Группа галоидов:
Хлорамин Б. Белый или слегка желтоватый порошок со слабым запахом хлора. Растворим в воде, спирте, содержит 25-29 % активного хлора. Обладает антисептическим действием. Применяют при лечении инфицированных ран (промывание, смачивание тампонов и салфеток 1-2 % растворами), дезинфекции рук (0,25-0,5 %), и дезинфекции неметаллического инструмента. Для обеззараживания предметов ухода и выделений при брюшнотифозной, паратифозной, холерной и других инфекциях кишечной группы и при капельных инфекциях (скарлатина, дифтерия, грипп и др.) применяют 1-2-3 % растворы, при туберкулезной инфекции — 5%.
Пантоцид, форма выпуска — таблетки, каждая содержит 3 мг активного хлора. Применяют для дезинфекции рук (1-1,5% растворы), спринцевания и обработки ран (0,10,5 %), для обеззараживания воды (1-2 таблетки на 0,5-0,75 л воды), которое происходит в течение 15 минут.
Йод — получают из золы морских водорослей и буровых нефтяных вод. Различают 4 группы препаратов йода:
— содержащие элементарный йод (раствор йода спиртовой, раствор Люголя);
— неорганические йодиды (калия йодид, натрия йодид);
— органические вещества, отщепляющие элементарный йод (йодоформ, йодинол);
— йодосодержащие органические вещества (рентгено-контрастные препараты).
Наружно растворы йода используют как противомикробное средство для обработки ран, подготовки операционного поля и т.п.; оказывая раздражающее действие, они могут вызвать рефлекторные изменения в деятельности организма.
Окислители:
Перекись водорода (пергидроль) — выпускается два препарата, представляющие раствор перекиси водорода в воде: раствор перекиси водорода 3 % и раствор перекиси водорода 27,5-31 % (концентрированный).При соприкосновении с органическими веществами и щелочами перекись водорода разлагается с выделением газообразного кислорода, который обладает антисептическими свойствами и способствует механической очистке тканей. Применяют как антисептическое средство для полосканий и промываний при ангине, стоматитах, отитах, а также при обработке ран в растворах из расчета 1 чайная ложка или 1 столовая ложка 3 % раствора на стакан воды.
Альдегиды:.
Циминаль. подавляет (местно) грамположительные и грамотрицательные бактерии, способствует эпителизации и заживлению ран. Применяют наружно при лечении ран, пиодермии, трофических язв, ожогов.
Дегти, смолы, продукты переработки нефти, растительные бальзамы:
Цигерол. применяют для лечения язв, гранулирующих ран, ожогов и т.д. Смачивают стерильную повязку (марлевую салфетку), которую накладывают на раневую поверхность и покрывают компрессной бумагой. При больших раневых поверхностях и обильном отделяемом компрессную бумагу не накладывают. Перевязку делают через 1-2 дня, при ожогах через — 4-5 дней.
Основным преимуществом антисептиков перед антибиотиками является то, что к ним значительно реже формируются устойчивые штаммы микроорганизмов, также они обладают высокой противомикробной активностью, которая проявляется в виде бактериостатического и бактерицидного действия, то есть способны уже в небольших количествах подавлять жизнедеятельность возбудителей. Антисептики более дешевые и доступные вещества по сравнению с антибиотиками, в разы превышающие их по эффективности.
Не смотря на большой выбор лекарственных средств, для лечения инфицированных ран, все еще остро стоит вопрос о сокращении сроков их заживления. Это связано с тем, что большинство лекарств современной медицины имеют однонаправленное действие и нерациональные комбинации с другими веществами в лекарственной форме.
Для устранения этих недостатков стоит вопрос о том, чтобы создать новые препараты, которые будут отвечать всем требованиям и пожеланиям со стороны медицины, для лечения ран под повязкой, а также веществ, которые обладали бы пролонгированным и разнонаправленным фармакологическим действием.
Исходя из этого, на это место можно предложить применение пептидов.
Пептиды — это цепочечные молекулы, содержащие от двух до ста остатков аминокислот, соединенных между собой амидными (пептидными) связями.
Пептиды непрерывно производятся во всех живых организмах для регуляции клеточных и тканевых процессов. Их активность в основном определяется их строением- последовательностью аминокислот, а также структурой частицы и ее положением в пространстве.
Классификация пептидов
1. По числу аминокислотных остатков, входящих в их молекулы:
1) Олигопептиды содержат до 10 аминокислотных остатков: — дипептиды — трипептиды — тетрапептиды и т.д.
2) Полипептиды содержат более десяти аминокислот. Природные полипептиды, которые содержат приблизительно от 50 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу более 5 тыс. дальтон, называются белками.
2. По составу:
1) Гомомерные пептиды при гидролизе образуют только аминокислоты.
2) Гетеромерные пептиды при гидролизе могут содержать также и неаминокислотный компонент, в зависимости от которого они называются: глико-, липо-, нуклео-, фосфопептиды и др.
3. По способу образовывать связи
1) Гомодетные пептиды, в которых аминокислотные остатки соединены между собой только пептидными связями.
2) Гетеродетные пептиды соединены не только пептидными, но и сложноэфирными, дисульфидными и другими связями. Гетеродетные пептиды со встроенными в цепь гидроксиаминокислотами называются пептолидами.
Пептиды, содержащие в молекуле остатки только одной аминокислоты, называются гомополиаминокислотами, а содержащие одинаковые повторяющиеся участки из одной или нескольких аминокислотных остатков — регулярными пептидами. Особая группа гетеромерных гетеродетных пептидов называется депсипептиды. Гомомерные и гетеромерные пептиды бывают линейными и циклическими.
4. По действию:
1) Пептиды-стимуляторы синтеза компонентов межклеточного матрикса (матрикины) — эти пептиды содержат не более 20 остатков аминокислот, образуются при ферментативном гидролизе структурных белков дермального матрикса (коллагена, эластина и фибронектина) на стадии естественного очищения раны перед тем, как она стала заживать. Матрикины подают сигнал о распаде компонентов матрикса фибробластам, которые в ответ начинают синтезировать новые компоненты в замен разрушенных. К ним относятся: Palmitoyl Pentapeptide-3, Palmitoyl Oligopeptide, Palmitoyl Tripeptide-1, Acetyl Tripeptide-11 и др.
2) Пептиды-стабилизаторы оказывают общеукрепляющее действием на кожу, повышая ее защитные свойства от рогового слоя до дермального матрикса. К ним относятся: Prezatide Copper Acetate, Diaminopropionoyl Tripeptide-33, Tripeptide-1, Hexapeptide-11 и др.
3)Пептиды-блокаторы мышечного сокращения — эти пептиды блокируют передачу сигнала о сокращении с нервного окончания на мышечное волокно, оказывая схожее действие с ботулотоксином, только менее выраженное. К ним относятся: Acetyl Hexapeptide-3, Pentapeptide-18, Pentapeptide-3, Acetyl Hexapeptide-25,Dipeptide Diaminobutyroyl Benzylamide Diacetate и др.
4)Пептиды-регуляторы процесса меланогенеза — эти пептиды воздействуют на процесс меланогенеза, ослабляя или усиливая выработку пигмента под действием ультрафиолета. К ним относятся: Palmitoyl Tripeptide-30, Acetyl Hexapeptide-1, Nonapeptide-1 и др.
5)Пептиды-иммуномодуляторы — эти пептиды подавляют секрецию провоспалительного цитокина, IL-6 и восстанавливают цитокиновый баланс. К ним относятся: Palmitoyl Tetrapeptide-7, Acetyl Dipeptide-3, Acetyl Tetrapeptide-2 и др.
6) Пептиды-нейротрансмиттеры — эти пептиды играют важную роль в нервной регуляции и сигнальном межклеточном взаимодействии. К ним относятся: Acetyl Dipeptide-1 Cetyl Ester, эндорфины и др.
7) Пептиды, улучшающие микроциркуляцию и лимфоотток — эти пептиды укрепляют сосудистую стенку. К ним относится: Acetyl Tetrapeptide-5.
В хирургической практике наиболее значимое значение имеют антибактериальные пептиды, состоящие из 24-40 аминокислот.
Пептиды непрерывно создаются в стабильном состоянии организма, а при воспалительных реакциях или повреждении тканей их синтез резко возрастает.
Каков механизм быстрого и эффективного уничтожения микроорганизмов антимикробными пептидами, до сих пор достоверно неизвестно. Однако, некоторые закономерности в строении и особенности их действия ученые уже выявили.
Антимикробные пептиды вполне могут заменить антибиотики, хотя они в некоторой степени слабее антибиотиков по чувствительности, работают пептиды значительно быстрее и самое главное то, что пептиды разрушают бактерии, невосприимчивые к устаревшим антибиотикам.
Антимикробные пептиды начинают активно вырабатываться клетками человеческого организма при локальных повреждениях или при наличии болезнетворных организмов, поэтому они оптимальны в терапии местных воспалений. Так как на сегодняшний день нет эффективных специфических антивирусных лекарственных средств, в противовирусном эффекте пептидов врачи видят прекрасные перспективы.
В связи с большим количеством послеоперационных осложнений, антибактериальные пептиды должны применяться в медицинской практике для положительной динамики течения заболевания, к тому же они имеют ряд преимуществ по сравнению с антибиотиками, которые используются в настоящее время.
Глава 2.Материалы и методы исследования
2.1Материалы исследования
Эксперименты in vivo выполнены на 210 крысах-самцах линии Vistar 180-220 г. Для исследования отбирались животные без внешних признаков заболевания, прошедшие карантин в виварии КГМУ. Все животные содержались на стандартном пищевом рационе в одинаковых условиях, в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях, принятой Советом Европы в 1986 году. Исследования проводили в одно и то же время суток – с 8 до 15 ч. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.
В процессе исследования применяли лекарственные и вспомогательные вещества, разрешенные к медицинскому применению и отвечающие требованиям действующей нормативно-технической документации.
В экспериментах изучались эффекты пептида глицил-гистидил-лизина NH2–Gly–His–Lys–COOH (GHL), синтезированного в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета («Реахим», Россия), а также пептидов Gly-His-Lis-D-Ala и D-Ala-Gly-His-Lis, синтезированных в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета, состоящих из четырёх аминокислот: Gly — глицин, His — гистидин, Lis — лизин, Ala — аланин. Эти пептиды участвуют в регуляции процессов роста и дифференцировки клеток, обладают выраженной гепатотропной активностью. В настоящее время ведется дальнейшее исследование этих пептидов, поскольку они являются малоизученными. Навески соответствующих препаратов растворяли в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия (NaCl) и вводили внутрикожно в объеме 0,1 мл с интервалом в 24 часа между инъекциями в течение 10 суток. Введение препаратов проводилось сразу после моделирования раневого процесса. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 часов до вывода животных из эксперимента. Вышеперечисленные пептиды использовали в разовых дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг массы.
Структура эксперимента.
В экспериментах на животных изучено ранозаживляющее действие пептидов Gly-His-Lis, Gly-His-Lis-D-Ala и D-Ala-Gly-His-Lis в разных концентрациях в первую и вторую фазу раневого процесса. В зависимости от используемого пептида и выбранной концентрации при лечении экспериментальной инфицированной раны животные были распределены на 7 серий. Распределение животных представлено в таблице 1.
Таблица 1.
Распределение животных по сериям в зависимости от способа лечения.
№ серии Название использованного пептида Сроки эксперимента (после начала лечения) 3-и сутки 7-е сутки 10-е сутки Всего
1 Контрольная серия без лечения 10 10 10 30
2 Лечение с использованием пептида Gly-His-Lis в дозировке 0,5 мкг/кг 10 10 10 30
3 Лечение с использованием пептида D-Ala-Gly-His-Lis в дозировке 0,5 мкг/кг 10 10 10 30
4 Лечение с использованием пептида Gly-His-Lis-D-Ala в дозировке 0,5 мкг/кг 10 10 10 30
5 Лечение с использованием пептида Gly-His-Lis в дозировке 1,5 мкг/кг 10 10 10 30
6 Лечение с использованием пептида D-Ala-Gly-His-Lis в дозировке 1,5 мкг/кг 10 10 10 30
7 Лечение с использованием пептида Gly-His-Lis-D-Ala в дозировке 1,5 мкг/кг 10 10 10 30
Итого 70 70 70 210
Животным под наркозом в стерильных условиях моделировалась инфицированная рана по методике Хотинян В.Ф. (1984). Для этого на выбритом от шерсти участке спины обработанном антисептиком иссекали кожу с подкожной клетчаткой размером 15×15 мм. На 1-е сутки (через 24 ч) после моделирования у всех животных формировалась инфицированная рана со всеми характерными признаками воспаления. Для стандартизации условий лечения, предупреждения деформации раны, а также для предупреждения высыхания, загрязнения раневой поверхности и укусов другими животными над раной подшивали к коже «Устройство для защиты ран» [Чердаков, А.В. Применение раневых покрытий биатравм и ресорб в комплексном лечении гнойных ран: (экспериментальное исследование): дис. … канд. мед. наук: 14.01.17 / А.В. Чердаков; Курский гос. мед. ун-т. – Курск, 2010. 115 с.]. Сразу после моделирования раневого процесса, а также на 3-и, 7-е и 10-е сутки раны фотографировали цифровой камерой с последующим измерением начальной (3-и сутки), промежуточной (7-е сутки) и конечной (через 10 суток) площадей ран.
Площадь исходной раны определяли путем нанесения контура на прозрачную пленку и затем выполняли обработку раны 3% раствором перекиси водорода. В соответствии с поставленной целью и задачами эксперимента животные были разделены на 7 серий, из которых контрольной была серия для лечения, в которой использовался 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор), а серией сравнения — лечение с использованием пептида Gly-His-Lis в дозировке 0,5 мкг/кг. Распределение животных по сериям представлено в табл. 1.
В контрольной серии животным ежедневно удаляли струп с раневой поверхности, далее производили инъекции 0,9% водным раствором хлорида натрия в четырех точках по периметру раны.
В серии №4 животным ежедневно удаляли струп с раневой поверхности, далее производили инъекции пептидом Gly-His-Lis-D-Ala в дозировке 0,5 мкг/кг в четырех точках по периметру раны.
В серии №7 животным ежедневно удаляли струп с раневой поверхности, далее производили инъекции пептидом Gly-His-Lis-D-Ala в дозировке 1,5 мкг/кг в четырех точках по периметру раны.
Перевязки экспериментальным животным во всех сериях производили один раз в день, ежедневно в течение 10 суток.
Методы исследования.
Течение раневого процесса у экспериментальных животных оценивали по внешнему состоянию раны, планиметрическим методом, микробиологическим, а также гистологическим с использованием морфометрии. Для контроля эффективности лечения и забора материала были выбраны следующие сроки: 3-и, 7-е и 10-е сутки от начала лечения.
При визуальном осмотре ран обращали внимание на состояние раны и фиксировали сроки ликвидации отека окружающих тканей, сроки очищения раны, появления грануляций и начала краевой эпителизации раны, полного заживления раны. Изменения перечисленных признаков фиксировали и выражали количественно, учитывая сроки лечения.
Планиметрический метод исследования. Для объективной оценки скорости заживления раны по изменению ее площади использовали метод Л.Н. Поповой в модификации В.И. Бирюкова [Герасимов, А.Н. Медицинская статистика: учеб. пособие для студентов мед. вузов / А.Н. Герасимов. М.: МИА, 2007. 475 с.: ил.]. Площадь ран определяли следующим образом: на рану накладывали прозрачную пленку, на которую черным маркером наносили ее контур (данную процедуру выполняли поочередно всем исследуемым животным).
Площадь ран рассчитывали следующим образом:
1. Пленка с полученными контурами сканировалась на белом фоне. Разре-шение при сканировании — 100-300 пикс/дюйм. Далее производилась обработка изображения с помощью программы «Adobe Photoshop» версии 3.0 и выше;
2. Фрагмент с контуром раны «вырезается» в отдельное окно и его контуры закрашиваются черным цветом с помощью опции «Заливка»;
3. Производится максимальное контрастирование изображения и удаление артефактов с помощью «ластика». Таким образом, получается изображение, состоящее только из черного и белого цветов, без полутонов;
4. Определяется размер изображения (его высота и ширина) используя оп-цию меню «Изображение» — «Размер изображения» и вычисляется его площадь. Площадь изображения = высота изображения х ширина изображения;
5. В меню «Изображение» — «Гистограмма» определяют, какую часть пло-щади изображения в процентах занимает черный цвет (т.е. площадь раны) и вычисляют эту площадь.
Определив площадь ран у экспериментальных животных в каждой серии, вычисляли среднюю площадь (M±m).
Процент уменьшения площади ран от исходного размера (т.е. процент заживления раны) вычисляли по формуле:
где ПУП – процент уменьшения площади,
S0 – исходная средняя площадь ран на начало лечения, мм2
S – средняя площадь ран на момент измерения, мм2.
Скорость заживления ран (т.е. процент уменьшения площади за су-тки) вычисляли по формуле:
где СЗ – скорость заживления,
ПУП1 – процент уменьшения площади ран от исходной на момент измерения,
ПУП0 – процент уменьшения площади ран при предыдущем измерении,
Т – количество дней между измерениями.
Микробиологическое исследование включало количественное опре-деление микроорганизмов в динамике в 1 г ткани инфильтрата по следующей методике. После выведения животного из эксперимента в стерильных условиях осуществляли забор участка инфильтрата раны массой 0,1-0,5 г, взвешивали и вычисляли коэффициент пересчета на 1 г ткани (К). Затем участок инфильтрата раны растирали в стерильной ступке и суспензировали в изотоническом растворе натрия хлорида из расчета 1:10. Далее делали десятикратные разведения суспензии в изотоническом растворе натрия хлорида до 10-3, а при необходимости и более. Из каждого разведения производили посев 0,1 мл суспензии в чашки Петри с плотной питательной средой (агар). Посевы инкубировали в термостате при температуре (37±1)°С в течение 20 ч, затем 1сут выдерживали при комнатной температуре. После этого производили подсчет колоний, выросших на чашке, и делали соответствующий пересчет на 1 г ткани. Подсчет колоний производили на тех чашках, где колонии росли изолированно и количество их не превышало 300.
Количество микроорганизмов на 1 г ткани вычисляли по формуле:
N = n x 10 х 10 (или 100, или 1000) х К, (4)
где N – количество микроорганизмов в 1 г биоптата,
n – количество микроорганизмов, выросших на чашке,
10 – пересчет на 1 г суспензии,
10, 100 или 1000 – разведение материала, засеянного на чашку, с которой ведут подсчет колоний,
К – коэффициент пересчета навески на 1 г биоптата.
Результаты микробиологического исследования консультированы ассистентом кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» к.м.н. Л.В. Жиляевой, за что мы выражаем ей искреннюю благодарность.
При цитологическом исследовании раневого процесса мы использовали «метод отпечатков», разработанный М.П. Покровской и М.С. Макаровым в 1942 г. [Раны и раневая инфекция: рук. для врачей / под ред. М.И. Кузина, Б.М. Костюченок. – 2 изд., перераб. И доп. – М.: Медицина, 1990. – 592 с.]. Техника этого метода заключается в следующем. До промывания раны растворами антисептиков стерильное предметное стекло прикладывают к тому участку раны, который необходимо исследовать. Таким образом делали целый ряд мазков-отпечатков с различных участков раны. На стекло сначала снимается отделяемое раны, а затем — клетки экссудата и микроорганизмы, находящиеся на самой ране. Мазки фиксировали смесью Никифорова (спирт-эфирный раствор) и окрашивали по способу Романовского-Гимзе. При исследовании мазков-отпечатков подсчитывали 100 клеток, и клеточный состав выражали в процентах. Мазки — отпечатки для цитологического исследования брали до начала лечения, на 3-и, 7-е, 10-е и 14-е сутки от начала лечения. Для определения типа цитограмм и фазы раневого процесса мы использовали схему О.С. Сергель и З.Н. Гончаровой [121], по которой выделяется пять основных типов цитограмм.
Первый тип (некротический) — характеризуется преобладанием в препарате детрита, фрагментов разрушенных нейтрофилов, микрофлоры, локализующейся преимущественно внеклеточно, отсутствием клеточных реакций и фагоцитоза.
Второй тип (дегенеративно-воспалительный) — отличается появлением признаков воспалительного процесса, что подтверждается начинающимся фагоцитозом (как правило, незавершенный или дегенеративный). В препарате определяется большое количество нейтрофилов в состоянии деструкции (кариопикноз, кариорексис, цитолиз).
Третий тип (воспалительный) — отражает нормальное течение воспаления (острого, подострого). Нейтрофилы средней степени сохранности составляют до 90 %, остальная часть клеток представлена в основном лимфоцитами, моноцитами, макрофагами и полибластами. Количество микрофлоры значительно уменьшается за счет возрастания фагоцитарной активности (наблюдается преимущественно завершенный фагоцитоз).
Четвертый тип (воспалительно-регенераторный) — соответствует неосложненному течению воспалительного процесса. Количество нейтрофилов в препарате уменьшается до 60—70 %, при этом отмечается увеличение их сохранности. 20—35 % клеток представлено лимфоцитами, фибробластами, макрофагами. Количество последних может достигать 5 – 10%, что является объективным критерием очищения раны от гнойно-некротических тканей. Соответственно значительно уменьшается количество микрофлоры. При более стертом характере клеточных реакций или присоединении осложнений, замедляющих течение раневого процесса, данный тип цитограммы именуется регенераторно-воспалительным.
Пятый тип (регенераторный) — характеризуется уменьшением количества нейтрофилов до 40—50 %, резким увеличением количества молодых клеток соединительной ткани (профибробласты и фибробласты, макрофаги и др.). Начинается процесс активной краевой эпителизации. В препарате эпителий определяется в виде пластов светлых клеток с широкой цитоплазмой. Микрофлора или отсутствует полностью, или присутствует в виде единичных колоний в поле зрения.
Первые три типа цитограммы характеризуют течение первой фазы раневого процесса (воспаления). На основании тенденций развития клеточных реакций, представленных в первых трех типах, можно судить об эффективности проводимой терапии и ставить показания к хирургическому лечению, включая повторную хирургическую обработку ран. Второй фазе течения раневого процесса свойственен преимущественно пятый тип цитограммы.
Гистологическое изучение раневых биоптатов производили на 3-и, 7-е, 10-е сутки от начала лечения после выведении подопытного животного из эксперимента путем передозировки наркоза. Забор материала осуществляли путем иссечения участка мягких тканей дна и прилежащего края раны лезвием. Взятый материал сразу фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина с последующей проводкой по восходящим спиртам и заливкой в парафин по стандартной методике. Приготовленные парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином. При оценке гистологических срезов обращали внимание на выраженность воспалительных реакций, сроки появления грануляционной ткани, возникновение краевой эпителизации, а также структурную полноценность вновь образованного эпителия.
Нами было выполнено также морфометрическое исследование, заключающееся в следующем: на срезах гистологических препаратов при увеличении х400, на выбранном участке в пределах раневого дефекта под лейкоцитарно-фибринозным струпом производили подсчет фибробластов, гранулоцитов, лимфоцитов и макрофагов до 100 клеток, полученные результаты выражали в процентах.
Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов и кислородзависимых механизмов антиинфекционной защиты.
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом (Фримель Г., 1987, Медведев А.Н. и др., 1991). Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов использовали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). ФИ (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и ФЧ (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому (Медведев А.Н., 1991). В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. Так же вычислялся индекс активности фагоцитов (ИАФ) (число фагоцитированных частиц латекса, умноженное на процент фагоцитирующих клеток и разделенное на число подсчитанных клеток).
Активность кислородзависимых механизмов защиты в фагоцитах оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Параллельно со спонтанным (НСТ-сп.) ставили стимулированный (НСТ-инд.), при этом в качестве стимулятора использовали зимозан. При микроскопии определяли количество (в %) диформазан-положительных клеток (Щербаков В.И., 1989). В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. Функциональный резерв рассчитывали как разность показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста. Результат выражался в процентах.
Статистическую обработку результатов исследования проводили на ЭВМ с использованием методов однофакторного дисперсионного анализа с помощью электронных таблиц Microsoft Excel 2007 и программы «Биостатистика». Вычисляли средние величины количественных показателей и их средние ошибки. Распределение признаков определяли по критерию Колмогорова. Достоверность различий средних величин между серией сравнения и остальными сериями оценивали по критерию Стьюдента, Манна-Уитни.
Для изучения динамики биохимических показателей крови соответствующих препаратов на основе пептидов использовались биохимические показатели крови. После моделирования гнойной раны все животные выжили.
Биохимические показатели крови.
Для сравнения показателей крови были выделены следующие показатели крови: АСТ; АЛТ; Каталаза; ОАА; МДА; АГП; НСТ; Фагоцитоз; Фч В1 фаг; Завершенность Фагоцитоза.
АСТ (АсАТ) или аспартатаминотрансфераза — клеточный фермент, участвующий в обмене аминокислот. АСТ содержится в тканях сердца, печени,почек, нервной ткани, скелетной мускулатуры и других органов. Благодаря высокому содержанию в тканях этих органов, анализ крови АСТ — необходимый метод диагностики заболеваний миокарда, печени и различных нарушений мускулатуры.
АлАТ (АЛТ) или аланинаминотрансфераза — фермент печени, участвующий в обмене аминокислот. Наряду с АСТ, в большом количестве содержится АЛТ в печени, почках, в сердечной мышце, скелетной мускулатуре. При разрушении клеток этих органов, вызванных различными патологическими процессами, происходит выделение АЛТ в кровь человека, а анализ покажетвысокий АлАТ в крови. В здоровом организме содержание показателя АЛТ в крови незначительно.
Каталаза — гемосодержащий фермент, осуществляющий защитную функцию в отношении перекиси водорода. Разложение перекиси водорода каталазой на молекулярный кислород и воду осуществляется в два этапа. При этом в окисленном состоянии каталаза работает и как пероксидаза, катализируя окисление спиртов или альдегидов. Кроме того, каталаза может выступать источником образования активных форм кислорода. Около 5% кислорода, образующегося в результате разложения, Н2О2 возникает в возбужденном синглетном состоянии. Максимальное содержание каталазы обнаружено в эритроцитах, значительное количество в печени и почках. Обладает специфической антиоксидантной защитой в отношении эндотелиальных клеток[21].
Общая антиокислительная активность – показатель антиоксидантной системы организма (защиты организма от токсического действия ряда соединений кислорода образующихся в организме — ионы кислорода, перекиси, свободные радикалы). Основные показания к применению: определение риска возникновения заболеваний, связанных с дефицитом в организме антиоксидантов, сахарный диабет, заболевания печени, почек, СПИД, заболевания сердечно-сосудистой системы (атеросклероз, инфаркт миокарда), опухолевые заболевания, оценка антиоксидантного статуса после голодания и диет с низким содержанием антиоксидантов.
В результате метаболических превращений веществ в организме образуются токсичные свободные радикалы кислорода (супероксидный ион — О2 -). Они образуются в реакциях перекисного окисления липидов (ПОЛ), при метаболизме различных препаратов, воздействии внешних факторов (действие ультафиолета, ионизирующее облучение). Образовавшись, они вступают во взаимодействие со структурами клетки, приводя, в конечном счете, к поражению мембран клеток, сопутствуя, таким образом, развитию патологического процесса при многих заболеваний. В организме существует защитная система, направленная на снижение токсического действия радикалов. Её можно разделить на три основные группы:
1. Первичные антиоксиданты ферменты (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза), белки (ферритин, трансферрин), которые предотвращают образование свободных радикалов.
2. Вторичные – витамины Е и С, каротин — способствующие выведению образовавшихся радикалов
3. Третичные – ферменты, осуществляющие репарацию поврежденных клеточных структур (например, на уровне репарации ДНК).
Данный метод исследования крови позволяет оценить активность всех антиоксидантных систем в целом.
Малоновый диальдегид в крови – один из показателей активности перекисного окисления липидов (ПОЛ). Основные показания к применению: заболевания сердечно-сосудистой системы, атеросклероз, диабет.
Одним из неблагоприятных последствий перекисного окисления липидов (ПОЛ) в результате действия радикалов кислорода и последующего разрыва полиеновых кислот, считается образование малонового альдегида.
Малоновый альдегид один из конечных продуктов перекисного окисления липидов, т.е. является продуктом расщепления жирных кислот. В свою очередь, этот альдегид образует шиффовы основания с аминогруппами белков, в результате чего образуются нерастворимые липидбелковые комплексы, которые иногда называют «пигментами изнашивания» (липофусцинами). По скорости образования малонового альдегида можно судить об активации ПОЛ. Активация ПОЛ наблюдается при различных заболевания: ишемия органов и тканей, диабет, атеросклероз и многих других[22].
Ацилгидроперекиси (АГП) определяли с использованием смеси гептана и изопропана с добавлением соляной кислоты. Образовавшийся гептановый слой измеряли спектрофотометрически при длине волны 233 нм против контрольной пробы. Результаты выражали в условных единицах.
Фагоцитоз — поглощение клеткой крупных частиц, видимых в микроскоп (например, микроорганизмов, крупных вирусов, повреждённых тел клеток и т.д.). Процесс фагоцитоза можно подразделить на две фазы. В первой фазе частицы связываются на поверхности мембраны. Во второй фазе происходят собственно поглощение частицы и её дальнейшее разрушение. Различают две основные группы клеток фагоцитов — моно-нуклеарные и полинуклеарные. Полинуклеарные нейтрофилы составляют первую линию защиты от проникновения в организм разнообразных бактерий, грибов и простейших. Они уничтожают повреждённые и погибшие клетки, участвуют в процессе удаления старых эритроцитов и очистки раневой поверхности.
Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе и диагностике иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующих гнойно-воспалительных процессах, длительно не заживающих ран, склонности к послеоперационным осложнениям. Исследование системы фагоцитоза помогает в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией. Наиболее информативным для оценки активности фагоцитоза считают фагоцитарное число, количество активных фагоцитов и индекс завершённости фагоцитоза.
Фагоцитарная активность нейтрофилов
Параметры, характеризующие состояние фагоцитоза.
■ Фагоцитарное число — среднее количество микробов, поглощённых одним нейтрофи-лом крови. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов.
■ Фагоцитарная ёмкость крови: норма — 12,5-25х109 на 1 л крови. Фагоцитарная ёмкость крови — количество микробов, которое могут поглотить нейтрофилы 1 л крови.
■ Фагоцитарный показатель: норма 65-95%. Фагоцитарный показатель — относительное количество нейтрофилов (выраженное в процентах), участвующих в фагоцитозе.
■ Количество активных фагоцитов: норма — 1,6-5,0х109 в 1 л крови. Количество активных фагоцитов — абсолютное количество фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови.
■ Индекс завершённости фагоцитоза: норма — более 1. Индекс завершенности фагоцитоза отражает переваривающую способность фагоцитов.
Полученные в ходе эксперимента данные показателей крови представлены в таблицах 2, 3, 4.
Из анализа представленных данных (Таблица 2): следует, что достоверные различия на 3 сутки присутствуют
• в сравнении 2 й серии с контролем по следующим показателям АСТ в 0,79; АЛТ-1,63; ОАА — 0,87; МДА -0,68; НСТ – 0,8; Фч – 0,63; Заверш. Фагоцитоза -0,9 раза.
• в сравнении 3 й серии с контролем по следующим показателям АЛТ-1,5; Каталаза-0,8; ОАА — 0,79; АГП -1,93; НСТ – 0,88; Фч – 0,48; Заверш. Фагоцитоза -0,78 раза.
• в сравнении 2 й серии с 3 й серией по следующим показателям АСТ в 1,22; Каталаза-0,68; ОАА — 0,91; МДА -1,56; АГП -2,26; Фагоцитоз – 0,93; Фч – 0,75; Заверш. Фагоцитоза -0,86 раза.
В остальных группах достоверных различий не выявлено.
Из анализа представленных данных (Таблица 3) следует, что достоверные различия на 7 сутки присутствуют:
• в сравнении 2 й серии с контролем по следующим показателям АЛТ-0,77; Каталаза – 0,74; ОАА — 0,92; МДА -1,71; Фагоцитоз – 0,93.
• в сравнении 3 й серии с контролем по следующим показателям АСТ-1,67; Каталаза-0,59; ОАА — 0,86; МДА -2,06; АГП -4,22; НСТ – 0,91; Фагоцитоз – 0,94; Заверш. Фагоцитоза -0,86 раза.
• в сравнении 2 й серии с 3 й серией по следующим показателям АСТ в 1,45; АЛТ – 1,36; Каталаза-0,8; ОАА — 0,94; МДА -1,21; АГП -3,35; Заверш. Фагоцитоза -0,9 раза
В остальных группах достоверных различий не выявлено.
Из анализа представленных данных (Таблица 4) следует, что достоверные различия на 10 присутствуют:
• в сравнении 2 й серии с контролем по следующим показателям АСТ в 0,83; АЛТ-1,25; Каталаза – 1,29; ОАА – 1,37; АГП -0,78; Фч – 1,21 раза.
• в сравнении 3 й серии с контролем по следующим показателям АСТ в 2,88; АЛТ – 4,25; Каталаза-0,91; ОАА -0, 68; МДА -2,95; АГП -4,38; НСТ – 055; Фагоцитоз – 0,77; Фч – 0,69; Заверш. Фагоцитоза -0,76 раза.
• в сравнении 2 й серии с 3 й серией по следующим показателям АСТ в 3,47; АЛТ – 3,41; Каталаза-0,7; ОАА — 0,49; МДА -3,05; АГП -5,6; НСТ – 0,53; Фагоцитоз -0,78; Фч-0,57; Заверш. Фагоцитоза -0,77 раза.
В остальных группах достоверных различий не выявлено.
Глава 3. Результаты исследования
Заключение
Причиной затяжного течения послеоперационного периода и существенного увеличения материальных затрат на лечение может быть инфицирование ран, в связи с чем приобретает большую социально-экономическую значимость в масштабах страны. Среди лекарственных средств наружного применения широко используются мази и гели на основах, которые не травмируют поврежденную поверхность при нанесении на рану, обеспечивают дренаж ран, а лекарственные вещества, входящие в их состав, обеспечивают необходимое лечебное действие .
Все вышеперечисленные обстоятельства обуславливают необходимость разработки лекарственных веществ на основе пептидов, и их всестороннее экспериментальное изучение в качестве средств для лечения инфицированных ран.
Эксперименты in vivo выполнены на 90 белых крысах линии «Вистар», в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях, принятой Советом Европы в 1986 г. Для исследования отбирали животных массой 180,0±20,0 г без внешних признаков заболевания, прошедших карантин в виварии ГБОУ ВПО КГМУ. Все животные содержались в одинаковых условиях на стандартном пищевом рационе. Животные были разделены на 3 серии по 30 животных в каждой. Всем животным под наркозом в стерильных условиях моделировалась инфицированная рана. Для стандартизации условий лечения: предупреждения деформации раны, высыхания, загрязнения раневой поверхности и укусов другими животными над раной подшивали к коже «Устройство для защиты ран» . Во всех сериях перед наложением повязки с исследуемым препаратом проводилась обработка ран 3% раствором перекиси водорода. В контрольной серии животным производилась ежедневная обработка раны 3% раствором перекиси водорода, выполнение инъекций в четырёх точках инфицированной раны с 0,9% раствором хлорида натрия. В 2 серии HLY-GYS-LYS-D-HLA ежедневно производилась обработка раны 3% раствором перекиси водорода, выполнение инъекций в четырёх точках инфицированной раны с лекарственным препаратом HLY-GYS-LYS-D-HLA в концентрации 0,5 мкг/кг. В 3 серии HLY-GYS-LYS-D-HLA ежедневно производилась обработка раны 3% раствором перекиси водорода, выполнение инъекций в четырёх точках инфицированной раны с лекарственным препаратом HLY-GYS-LYS-D-HLA в концентрации 1,5 мкг/кг. Перевязки экспериментальным животным во всех сериях производили один раз в день, ежедневно в течение 10 суток.
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови исследовали после их инкубации с латексом. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов использовали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ). ФИ (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и ФЧ (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. Так же вычислялся индекс активности фагоцитов (ИАФ) (число агоцитированных частиц латекса, умноженное на процент фагоцитирующих клеток и разделенное на число подсчитанных клеток).
Активность кислородзависимых механизмов защиты в фагоцитах оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Параллельно со спонтанным (НСТ-сп.) ставили стимулированный (НСТ-инд.), при этом в качестве стимулятора использовали зимозан. При микроскопии определяли количество (в %) диформазан-положительных клеток. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. Функциональный резерв рассчитывали как разность показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста Результат выражался в процентах.
Статистическую обработку результатов исследования проводили на ЭВМ с использованием методов однофакторного дисперсионного анализа с помощью электронных таблиц Microsoft Excel 2010 и программы «Биостатистика». Вычисляли средние величины количественных показателей и их средние ошибки. Распределение признаков определяли по критерию Колмогорова. Достоверность различий средних величин оценивали по критерию Манна-Уитни .
Рис.1 Динамика изменения АСТ крови
На 3-и сутки достоверно уменьшилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг по сравнению с контролем в 1,75 раз, также на 3-и сутки достоверно уменьшилась динамика Серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг по сравнению с контролем в 1,37 раз.
На 7-е сутки достоверно уменьшилась динамика Серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5мкг/кг по сравнению с контролем в 2,9 раз, а динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг уменьшилась по сравнению с контролем в 3,2 раза.
На 10-е сутки достоверно увеличилась динамика серий Серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 и 1,5 мкг/кг по сравнению с контролем соответственно в 2,3 и 1,4 раза.
Рис.2 Динамика изменения АЛТ крови
На 3-и сутки достоверно увеличились динамики Серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг по сравнению с контролем в 5,4 и 5,1 раз соответственно.
На 7-е сутки достоверно увеличились динамики серий обеих концентраций в 4,7 и 3 раза
На 10-е сутки достоверно увеличились динамики серий Серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 1,4 и 1,43 раза.
Рис.3 Динамика изменения Каталазы крови
На 3-и сутки достоверно Увеличились динамики серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 1,26 раз и 1,15 раз соответственно по сравнению с контролем.
На 7-е сутки достоверно увеличились оба показателя серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 1,7 и 1,4 раза по сравнению с контролем
На 10-е сутки достоверно увеличилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,4 раза. Динамика же серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг уменьшилась по сравнению с контролем в 1,01 раз.
Рис.4 Динамика изменения МДА крови.
На 3-и сутки достоверно уменьшились по сравнению с контролем серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг соответственно в 9,3 и 3,4 раза.
На 7-е сутки достоверно уменьшились по сравнению с контролем серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг соответственно в 1,9 и 2,1 раз.
На 10-е сутки динамики серий обеих концентраций увеличились по сравнению с контролем в 1,9 и 1,4 раза.
Рис.5 Динамика изменения ОАА крови.
На 3-и сутки достоверно уменьшились показатели серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 4,3 и 1,7 раз соответственно.
На 7-е сутки также достоверно уменьшились показатели обеих серий в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 1,56 и 1,8 раз соответственно.
На 10-е сутки достоверно уменишились показатели серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг и HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг в 1,3 и 1,18 раз соответственно
Рис.6 Динамика изменения АГП крови.
На 3-и сутки достоверно уменишилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,03 раза, также на 3-и сутки достоверно увеличилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 в 1,11 раз.
На 7-е сутки достоверно уменьшилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,15 раз и достоверно увеличилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг в 1,17 раз по сравнению с контролемю
На 10-е сутки достоверно увеличились динамики серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 3,2 и 1,9 раз по сравнению с контролем.
Рис.7 Динамика изменения НСТ крови.
На 3-и сутки достоверно увеличились динамики серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг по сравнению с контролем в 11,5 и 15,38 раз соответственно.
На 7-е и 10-е также достоверно увеличились динамики серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 19,5 и 17,42 раз на 7-е сутки и в 1,7 и 1,34 раз на 10 сутки соответственно по сравнению с контролем.
Рис.8 Динамика изменения фагоцитоза.
На 3-и сутки достоверно увеличилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,15 раз по сравнению с контролем, а серия HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг достоверно увеличилась по сравнению с контролем в 1,09 раз.
На 7-е сутки отмечено достоверное увеличение серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 мкг/кг и 1,5 мкг/кг в 1,03 и 1,07 раз соответственно по сравнению с контрольными показателями.
На 10-е сутки достоверно ументшилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,16 раз, а динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 достоверно уменьшилась в 1,06 раз по сравнению с контрольными показателями.
На 3-и сутки достоверно уменьшилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг 1,44 раза, динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг достоверно уменьшилась в 1раз по сравнению с контрольными показателями.
На 7-е сутки достоверно уменьшились динамики серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг в 1,28 и 1,22 раз соответственно по сравнению с контролем.
На 10-е сутки достоверно уменьшилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,09 раз. Динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг достоверно увеличилась в 1,06 раз в сравнении с контрольными показателями.
Динамика изменения завершенности фагоцитоза.
На 3-и сутки достоверно уменьшилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,09 раз, а динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 мкг/кг достоверно уменьшилась в 1,12 раз по сравнению с контрольными показателями.
На 7-е стуки достоверно уменьшились динамики серий HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрациях 0,5 и 1,5 мкг/кг по сравнении. С контрольными показателями в 1,13 и 1,11 раз соответственно.
На 10-е сутки достоверно уменьшилась динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 0,5 мкг/кг в 1,07 раз по сравнению с контролем, а динамика серии HLY-GYS-LYS-D-АLA в концентрации 1,5 достоверно увеличилась в 1,01 раза по сравнению с контрольными показателями.